Master Assassin Ezio Auditore, nå eldre og mer erfaren enn noen gang, legger ut på en episk reise for å avdekke den tapte biblioteken til Altair. Denne legendariske biblioteken sies å inneholde hemmeligheter som kan være avgjørende for å bekjempe Tempelridderne en gang for alle. Men underveis støter Ezio på en sjokkerende oppdagelse. Biblioteken skjuler ikke bare gammel visdom, men også den mest urovekkende hemmeligheten verden noen gang har kjent.
